基于泊松分布將核酸樣本分散到大量微孔或者液滴中（如圖1），相較于qPCR而言，dPCR無需標準曲線（如圖2），抑制成分被有效稀釋（如圖3），讀取結果方式具備更精確結果的潛力。盡管有諸多優(yōu)勢，我們?nèi)孕柚匾昫PCR的操作過程、試劑耗材穩(wěn)定性及硬件性能帶來的影響；同時需針對性的完善實驗細節(jié)，從而盡可能減少引入的偏差，獲得高靈敏度、高穩(wěn)定性的實驗結果。
圖1.dPCR實驗原理圖例
（來源：羅氏診斷整理）
圖2.無需依靠通過標準品繪制的標準曲線
（來源：羅氏診斷整理）
圖3.將樣本分散到微孔后可以降低體系抑制成分的抑制效果
（來源：羅氏診斷整理）
完整的數(shù)字PCR操作流程：
a.取樣過程：
絕大多數(shù)生物學實驗在取樣過程中會引入取樣偏差，因此在此操作過程中應盡量保持取得樣本的操作一致，并且在不提高抑制物濃度的條件下，應盡量增大取樣體積，選取低吸附樣本管的耗材。
針對樣本本身，如果是全基因組核酸進行數(shù)字PCR研究則需要進行片段化處理。細菌，病毒等樣本通常需要結合多重靶標檢測，實驗設計時需分析靶點序列在基因組上的物理距離，并針對性的設計靶點引物或酶切干預來減少后續(xù)結果中出現(xiàn)的多靶標連鎖問題。
b.體系配置：
此步驟主要涉及移液偏差。dPCR儀器移液步驟越多，誤差越大，因此在此操作過程中盡可能減少移液次數(shù)，同時選擇校準過的最接近量程的移液器結合合適的低吸附槍頭（如圖4）。
移液操作通常為反向移液，對于低濃度樣本盡可能增加重復以防止低分子隨機性因素導致結果不穩(wěn)定，高濃度探針引物稀釋后移液可以減少批間誤差。以手動單道移液器為例（如圖5），同樣是移取20 μl液體，選擇量程是20 μl的移液器時精度≤±0.8%，換算成體積為±0.16μl；而選擇量程是200μ的移液器時精度為≤±6%，體積偏差在±1.2μl 。
圖4.dPCR加樣時吸頭角度
（來源：羅氏診斷整理）
圖5.針對不同量程移液器移液過程的誤差數(shù)據(jù)
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c.分散過程：
有效反應單元數(shù)量是影響結果準確性和精確性的重要因素（如圖6）。以泊松分布為基礎來測算核酸濃度，需要在精度和動態(tài)范圍之間取得平衡。相同反應單元下，精度要求越高，動態(tài)范圍越小，精度要求越小，動態(tài)范圍越大，因此提高有效反應單元數(shù)量，可同時提高精度和動態(tài)范圍。
圖6.20k,28k,100k微孔數(shù)目下，芯片孔越多，計算核酸濃度的準確性越高
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在反應單元一致的前提下，樣本體積越大，越有利于低拷貝基因的檢測。
分散過程中的誤差分析：統(tǒng)計學樣本濃度均值λ，即平均一個分區(qū)單元包含λ個拷貝不一定剛好是真實模板濃度，需要結合置信區(qū)間和置信水平表示,數(shù)字PCR中置信水平通常是95%，而針對置信區(qū)間科研和商業(yè)化公司有多種計算方式。
???絕對定量誤差分析，見圖例CI區(qū)間（如圖7）。
圖7.dPCR絕對定量結果CI統(tǒng)計區(qū)間
（來源：羅氏診斷整理）
???CNV誤差分析更為復雜，需要目標基因和內(nèi)參基因濃度比ratio值及相應的聯(lián)合置信區(qū)間進行表示，見圖例CI區(qū)間（如圖8）。
圖8.dPCRCNV結果CI統(tǒng)計區(qū)間
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d.信號采集：
信號采集過程中熒光粉塵、交叉污染，都會影響正常陰陽單元的判定，可通過在超凈臺操作有效降低前者的影響。后者往往對反應單元的信噪比和單元間隔絕性有比較高的要求（如圖9），原理上微滴法很難控制微滴間干擾和液滴融合等問題，相較而言以芯片為反應單元的數(shù)字PCR設備可以通過提高微孔工藝進而解決此類問題。
圖9.孔之間應有較大間隔，可以避開孔之間的交叉干擾，獲取更好的信噪比
（來源：羅氏診斷整理）
1D,2D結果中閾值的判讀也是影響最終結果的重要因素。由于試劑耗材組分、非特異性擴增、探針引物二聚體等現(xiàn)象，導致背景噪音更為明顯，導致陰陽性孔間閾值難以劃分（如圖10）。優(yōu)化探針引物序列和配比、摸索合適的退火溫度、配合低背景芯片耗材（如圖11），同時結合硬件，比如結合使用高分辨率的光學檢測系統(tǒng)、高性能的PCR溫控系統(tǒng)可以有效提高信噪比，使閾值能夠準確劃分。
圖10.1D圖陰性（藍色）與陽性（紅色）信號應考察聚集度、信噪比、有無Rain等指標
（來源：羅氏診斷整理）
圖11.芯片標準化的六邊形微腔
（來源：羅氏診斷整理）
以上就是數(shù)字PCR實驗流程常見的幾類問題和參考性的解決方案。我們在實驗中面對小分子樣本的隨機性，雖然無法超越不確定性極限達到確定，但通過細節(jié)把控和數(shù)據(jù)優(yōu)化，使我們可以通過高效的方案進行實驗。
*MC-CN-02168 有效期至2025年5月16日
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